Исследование новых биологически активных соединений и создание на их основе лекарственных препаратов остается одной из самых горячих точек современной науки. Целые институты и отдельные исследовательские группы, работая в этом направлении, вносят свой вклад в борьбу с болезнями, угрожающими жизни и здоровью человека и наносящими серьезный экономический ущерб. В институтах Новосибирского научного центра под научно-методическим руководством Сибирского отделения РАН также ведутся активные исследования, ориентированные на поиск новых лекарственных агентов. Одной из таких организаций является Новосибирский институт органической химии им. Н. Н. Ворожцова СО РАН, имеющий в своем составе подразделение, непосредственно нацеленное на решение этой задачи, — отдел медицинской химии. Его основатель — академик Генрих Александрович Толстиков — заложил основы для успешной работы отдела в современных условиях, определив научные направления и сформировав костяк коллектива из сотрудников НИОХ СО РАН с привлечением коллег из других институтов, объединив специалистов разного профиля: химиков-синтетиков и «природников», фармакологов и медиков.
«Наука в Сибири» заглянула на «кухню» отдела медицинской химии НИОХ СО РАН, где непосредственно готовятся будущие лекарства, и понаблюдала за процессом их рождения на примере поиска соединений для лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы — аденомы простаты.
От идеи…«Сейчас изучение биологически активных веществ очень востребовано, — рассказывает заведующая лабораторией фармакологических исследований НИОХ<профессор, доктор биологических наук Татьяна Генриховна Толстикова, — и наше подразделение занимает здесь уникальную нишу. Химики отдела нацелены прежде всего на решение задач, связанных с поиском агентов, потенциально ценных для терапии социально значимых заболеваний, таких как сердечно-сосудистые, онкологические, нейродегенеративные, воспалительные и другие патологии. Основной задачей нашей лаборатории является проведение широкого первичного скрининга новых, только-только полученных «в пробирке» соединений с целью определения наиболее перспективных агентов. У нас есть всё для этих работ: специальная аппаратура, экспериментальные модели, подопытные животные разных линий, сотрудники с необходимой компетенцией. Направлений, в которых работает лаборатория, много: это исследование анальгетической, противовоспалительной, гепатопротекторной, антигипертензивной, антиаритмической, гиполипидемической, противоопухолевой активностей. Мы гибко перестраиваемся под текущие задачи. Одной из последних появилась тема, связанная с исследованием соединений, которые могут применяться в терапии доброкачественной гиперплазии предстательной железы. Вокруг этой проблематики уже сложился временный научный коллектив из сотрудников разных лабораторий, большинство из которых — молодые кандидаты наук».
«Наша лаборатория обратилась к этой теме по инициативе моего аспиранта, выпускника медицинского факультета Новосибирского государственного университета Сирожиддина Ашуралиевича Низомова, который, поступив в аспирантуру по специальности “фармакология”, убедил нас заняться проблемой доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ), — говорит ведущий научный сотрудник лаборатории фармакологических исследований доктор биологических наук Ирина Васильевна Сорокина. — Его интерес не был случайным, так как он, будучи молодым дипломированным врачом-урологом, уже имел общее представление о проблемах лечения таких больных. Несмотря на то, что риски для аспиранта, связанные с необходимостью работы с чистого листа, были высоки, эта инициатива была поддержана руководителями и нашей лаборатории, и отдела медицинской химии. При выборе этой тематики нас вдохновила прежде всего масштабность проблем, связанная с высокой заболеваемостью и недостатком эффективных и безопасных препаратов для лечения ДГПЖ».
…до постановки задачи
Доброкачественная гиперплазия предстательной железы — хорошо известное заболевание, связанное с незлокачественным ростом простаты. Со временем увеличение ее объема приводит к сдавливанию шейки мочевого пузыря и уретры, что вызывает расстройство мочеиспускания (синдром нижних мочевых путей) и в значительной степени снижает качество жизни пациентов. Симптомы болезни проявляются в 50-летнем возрасте примерно у 50 % мужчин, количество страдающих этим недугом увеличивается на 10 % каждые 10 лет и достигает 80 % к 80-летнему возрасту. Фактически ДГПЖ — это неизбегаемое заболевание, которое возникает и развивается на фоне общего старения мужского организма и тех неблагоприятных изменений, которые ему сопутствуют: ожирения, повышения глюкозы в крови, окислительного стресса и воспалительных процессов в тканях.
«Однако главной причиной ДГПЖ считается возрастная гормональная перестройка, прежде всего — снижение секреции тестостерона. На этом фоне нарушается баланс тестостерона с эстрогенами, уровень которых сохраняется. Этот сдвиг вызывает компенсаторное увеличение в клетках простаты активности фермента 5-альфа-редуктазы, превращающей тестостерон в гораздо более активный андроген — дигидротестостерон, — объясняет Ирина Сорокина, — который стимулирует деление клеток и рост железы».В настоящее время наиболее эффективными лекарствами при аденоме простаты являются синтетические ингибиторы 5α-редуктазы — препараты «Финастерид» и «Дутастерид», которые задерживают рост простаты на 30—50 %. Однако, несмотря на то, что ингибиторы этого фермента являются «золотым стандартом» лечения ДГПЖ, вышеупомянутые лекарства обладают серьезными побочными эффектами, затрудняющими проведение длительных курсов лечения. Определенной, хотя и слабой альтернативой этим средствам являются малотоксичные растительные препараты на основе экстрактов африканской пальмы Serenoa repens («Пермиксон», «Простамол Уно»), применение которых оправдано только на ранней стадии болезни. Поэтому поиск эффективных и малотоксичных ингибиторов 5α-редуктазы остается крайне актуальной и важной задачей.
«Исходя из этого, перед нами стояла задача найти перспективные лекарственные агенты, которые уменьшали бы активность фермента 5α-редуктазы и снижали пролиферативные процессы в ткани простаты. При этом важно было выбрать подходящие для синтеза исходные соединения, а также адекватные экспериментальные модели ДГПЖ in vivo», — говорит Ирина Сорокина.
Выбрать соединения-кандидаты
Для того чтобы начать поиск, ученые должны понять, вещества каких химических классов способны оказать необходимые полезные эффекты, и выбрать из них соединения-кандидаты для целенаправленного синтеза. «Несмотря на то, что мировым трендом в получении соединений с простатотропной активностью являются синтетические трансформации половых стероидов, мы предположили, что нужными нам эффектами могут также обладать фенолы, а еще — растительные и животные метаболиты, структурно близкие к стероидам: тритерпеноиды и желчные кислоты. Фенольные соединения являются эффективными антиоксидантами и противоишемическими агентами, влияют на рост и размножение клеток. Тритерпеноиды обладают противовоспалительной и иммуномодулирующей активностью, стимулируют репаративные процессы, апоптоз, подавляют фиброгенез. Желчные кислоты являются регуляторами различных метаболических процессов в животном организме, например липидного обмена и метаболизма глюкозы, широко встречаются в определенных формах в живых организмах, — рассказывает Ирина Сорокина. — Мы хотели бы, чтобы конечные соединения в той или иной степени сохраняли биологические свойства исходных молекул, что дополняло бы их основной мишень-ориентированный простатотропный эффект».
Старший научный сотрудник лаборатории физиологически активных веществ кандидат химических наук Оксана Владимировна Саломатина поясняет, чем еще руководствовались ученые-химики в выборе объектов для химический трансформации: «Важна была доступность стартовых соединений, возможность получения из возобновляемого сырья и, конечно, дешевизна, чтобы проводить химические трансформации».
Изначально исследователи ориентировались прежде всего на тритерпеноиды, однако научный сотрудник этой же лаборатории кандидат химических наук Ирина Игоревна Попадюк предложила использовать в качестве исходных соединений также и животные метаболиты, а именно — желчные кислоты, обладающих высокой биологической активностью и высоким сродством к различным клеточным мишеням в организме. «Тем более что они являются биогенетическими родственниками тритерпеноидов, и есть возможность сравнивать их поведение, плюсы и минусы как возможных простатотропных агентов и, вероятно, найти какие-либо закономерности “структура — биологическая активность”», — добавляет Оксана Саломатина.
Рассчитать…
«После того как мы выбрали исходные соединения и наметили возможные пути их синтетической трансформации, необходимо было убедиться, действительно ли конечные вещества могут взаимодействовать с 5α-редуктазой, — говорит Ирина Сорокина. — Для этого следовало оценить возможность их связывания и активность по отношению к заданной мишени».
На этом этапе ученым требуется лишь компьютер и специальное программное обеспечение. «Задав ту или иную структуру вещества, можно многое сказать о том, как оно будет действовать», — комментирует старший научный сотрудник лаборатории фармакологических соединений кандидат биологических наук Дмитрий Сергеевич Баев.Это можно представить как паззл: в белке-мишени есть некое пространство строго определенной конфигурации, куда способна оптимально встраиваться молекула действующего соединения (обладающая подходящими размерами, связями и свойствами). Программное обеспечение позволяет визуализировать такую молекулу, трансформировать ее — например, менять углы между атомами и, соответственно, пространственную ориентацию. Компьютерный алгоритм подгоняет все возможные варианты в нужное место и рассчитывает энергию взаимодействий. Чем она ниже, тем лучше.
«Если говорить о желчных кислотах, то было сделано предположение: эти молекулы, если их модифицировать, смогут быть ингибиторами мишеней, которые отвечают за гиперплазию простаты, — рассказывает Дмитрий Баев. — Были выбраны две платформы, чтобы на их базе искать варианты, — в частности, дезоксихолевая кислота. Она очень распространена в природе, есть возможность получить на ее основе виртуальную библиотеку соединений, которые в дальнейшем могут быть синтезированы. Полученные соединения уже исследуются как вероятные ингибиторы мишеней, чтобы предложить варианты модификации в зависимости от мишени, с которой соединение будет взаимодействовать».
Проанализировав литературу, ученые выбрали две биологические мишени: 5-альфа-редуктазу и цитохром-17-а, они обе участвуют в синтезе андрогенов и эстрогенов, так что нужно было подобрать соединение, блокирующее фермент и способное прерывать цепь синтеза гормонов.
«Фактически это скрининг, — говорит Дмитрий Баев. — Наша основная задача — ранжировать множество молекул по аффинности, то есть по способности прочно связываться с мишенью. Чем более высокий аффинитет у молекулы, тем больший интерес она вызывает. Мы можем просчитать эффективность и подсказать химикам, что в первую очередь нужно изменить в молекуле, перед тем как отдать ее на биологические испытания. Могу сказать: структур соединений, из которых мы искали самые лучшие, через нас прошло около сотни».
…а потом синтезировать
К началу биологических испытаний в руках фармакологов были два фенольные соединения, предоставленные заведующим кафедрой химии Новосибирского государственного педагогического университета профессором, доктором химических наук Александром Евгеньевичем Просенко, а также тритерпеноид динатриевая соль глицирризиновой кислоты. Производные дезоксихолевой кислоты еще предстояло синтезировать.
«Несмотря на то, что желчные кислоты очень доступны (являются побочными продуктами животноводства), химических трансформаций этих соединений до нас было сделано очень мало, — говорит Оксана Саломатина. — Скорее всего, это связано со сложностью работы с желчными кислотами — но у нас очень хороший опыт с тритерпеноидами, так что мы смогли провести схожие модификации. После создания виртуальной библиотеки и выбора двух мишеней, получилось по 15 перспективных соединений для одной и 10 — для другой. На сегодняшний день мы посмотрели корреляции, и в первую очередь синтезируем те вещества, которые входят в обе группы и действуют на оба фермента».
«Обычное количество соединения, необходимое для проведения полноценного эксперимента на взрослых крысах, составляет два грамма. Оно кажется небольшим, но его получение требует много времени и наличия дополнительных свободных рук, что частично решается за счет привлечения к работе студентов-дипломников. В данном случае нам помогали два бакалавра из НГПУ», — говорит Ирина Попадюк, которая отвечала за этот этап работы.Смоделировать…
Еще одна задача, которую необходимо было решить, заключалась в подборе адекватных патогенетических экспериментальных моделей ДГПЖ — обычный путь, предшествующий испытаниям перспективных агентов на людях. Здесь на помощь приходят лабораторные животные, однако воспроизвести на них полноценную доброкачественную гиперплазию предстательной железы, максимально имитирующую таковую у человека, достаточно сложно, учитывая многофакторность заболевания.
«Тем не менее перед аспирантом Сирожиддином Низомовым сразу была поставлена задача: освоить модели, где симптомы, схожие с ДГПЖ человека, достигаются у животного путем создания гормонального сдвига, вызывающего усиление синтеза дигидротестостерона. А это прямо связано с усилением активности 5α-редуктазы. В настоящее время известны две такие модели, одна из которых основана на повышении уровня гипофизарного гормона пролактина (сульпиридная модель), а вторая — андрогенов (тестостероновая модель). В первом случае гиперпролактинемия усиливает экспрессию 5α-редуктазы внутри простаты, что приводит к увеличению продукции дигидротестостерона и одновременно повышает чувствительность к нему андрогеновых рецепторов. Эти факторы способствуют увеличению роста клеток простаты, прежде всего железистого эпителия. Ирина Сорокина отмечает, что эта модель используется томскими учеными, в частности профессором, доктором биологических наук Татьяной Геннадьевной Боровской. Тестостероновая модель используется в основном зарубежными учеными и относительно мало известна в России, что потребовало больше усилий и времени на ее отработку в тестовых экспериментах. «С ней пришлось повозиться, чтобы она работала как положено, и благодаря упорству Сирожиддина Низомова на этой модели получено большинство результатов», — отмечает Ирина Сорокина.
…и проверить
Большая часть исследования связана с кропотливым анализом гистологических препаратов ткани предстательной железы, полученной в результате экспериментов. От того, насколько квалифицированно будет выполнена морфологическая часть работы, зависят все основные научные результаты. Эта часть исследования выполняется под руководством ведущего научного сотрудника доктора медицинских наук Натальи Анатольевны Жуковой, которая курирует работу молодых специалистов. Один из них, кандидат биологических наук Сергей Алкисович Борисов, как раз участвует в морфометрическом анализе препаратов простаты, что дает количественную оценку эффекта тех или иных агентов. Для этого исследователь внимательно просматривает множество микрофотографий тканей органа и описывает состояние его различных участков, а затем сравнивает с данными контрольной и референсной групп. Результаты этой работы позволят сделать вывод о том, оправдались ли прогнозы, сделанные в ходе виртуального скрининга.
«Это относительно стандартные морфометрические методики, — объясняет Сергей Борисов. — Берется срез простаты, и под микроскопом делается целый ряд фотографий разных мест этого среза. На каждом изображении нужно посчитать, какую долю занимает каждая ткань. Для этого используются специальные сетки, соответствующие определенному полю зрения — для одной фотографии мы смотрим 25 полей зрения. Накладывая эту сетку на картинку, можно узнать объемную плотность тканей: соединительной, мышечной, фибробластов, железистого эпителия, который как раз растет недолжным образом. Это очень кропотливая и долгая, но очень важная работа».А также скоординировать и направить
«Практически все исследователи, которые занимаются этим направлением, — молодые ученые, кандидаты наук, — отмечает Ирина Сорокина. — Однако не надо забывать и о роли старших коллег, тех, кто задает и корректирует вектор научного поиска, а также отвечает за качество исследований и итоговый результат. Их подготовка и опыт работы используются при планировании и проведении экспериментов, анализе и интерпретации полученных данных, помогает увидеть картину в целом и оценить перспективы. Здесь помощь зрелых специалистов неоценима».
Сама Ирина Васильевна отвечает за общую стратегию, планирование исследований и анализ результатов, а Наталья Анатольевна Жукова — за проведение квалифицированного морфологического исследования тканей предстательной железы и получение объективных данных о простатотропной активности изучаемых агентов. На данный момент первые статьи с результатами по простатотропной активности фенольных соединений и глицирризиновой кислоты приняты в печать, ведется подготовка патента и дальнейших публикаций по производным дезоксихолевой кислоты. Работа с желчными кислотами планируется на долгую перспективу.«Первые результаты уже обнадеживают нас, эти кислоты оказывают простатопротекторное действие, а также регулируют липидный обмен и уровень глюкозы, затрагивая, таким образом, все реперные точки ДГПЖ, — говорит Ирина Сорокина. — Полученный экспериментальный задел позволяет нам с оптимизмом смотреть на развитие этой тематики в будущем. Разумеется, расширение работы и вовлечение в нее других специалистов потребует увеличения финансирования (пока оно ведется за счет бюджетных и внебюджетных источников). Этот вопрос, по-видимому, будет решаться за счет подготовки заявок на гранты».
«Это очень интересное направление, — поддерживает коллегу Татьяна Толстикова. — Оно касается решения крайне важной проблемы, распространенной во всем мире, причем лекарств и методов терапии мало. Задача перед нами стоит сложная, нужно найти подходы к лечению, разработать те лекарственные агенты, которые, мы надеемся, доведем до стадии препарата. Конечно, всестороннюю поддержку нам оказывает дирекция института и руководитель отдела медицинской химии НИОХ СО РАН профессор, доктор химических наук Нариман Фаридович Салахутдинов».
Екатерина Пустолякова
Источники
От лаборатории - до аптеки
- Наука в Сибири (sbras.info), 22/05/2019
От лаборатории - до аптеки>